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快速繁殖的研究方法——

怎样选取最佳培养方案

植物组织培养所阐述的理论内容，在应用到具体植物和每个人所面临的试验条件时，都会遇到一些问题，如怎样协调各个环节，怎样选取一些最佳条件，工作中出现的情况怎样判断是否正常，怎样克服不利影响，怎样诱导培养物朝我们所希望的方向发展等等。下面将介绍一些解决上述问题的方法，即提出问题、设计实验，通过对实验结果的分析，找到答案。许多实验方法在多数情况下要结合自己的工作经验加以灵活运用。

在介绍各单项因素选取之前，先对常用的试验方法加以简要说明。

（一）、 植物组织培养中常用的试验方法

1、 预备性试验

在对某种植物发生兴趣，或对某项因素产生疑惑，或阅读某篇论文后联想到自己的试验中有类似的问题，要初试一下，就可以简单拟定一个方案，比较粗略地判断一下○1该因素是否有影响？○2如果有影响，它大体的程度和数量如何？能用一次较粗略的试验判断出上面两个问题，就基本达到预期目的了。然后便可循着预备试验的路子，设计较为完整的实验方案，已取得准确可靠的试验数据和加深对问题的认识。

预备性试验要求比较低，不必深思熟虑，不必很严格，往往灵机一动就做了。植物组织培养条件一旦具备之后，可以做许多工作，做了就摆在那里，观察培养物的反应，有反应的再接着做。通常愈有实验经验的人，愈能判断准确，是预备性试验有较高的命中率，能尽快发现科学研究上的突破口，并由此扩大战果。

预备性试验规模较小，条件要求不必面面俱到。在精力允许的情况下多做一点预备性试验，它能加快前进的步伐。预备性试验得出否定的结果也是极有用的信息，它可能预示问题不在这方面，或问题并不简单，这样也会使研究的思考深化。总之预备性试验耗费时间与精力较少，问题直截了当，能使下一阶段的工作更有把握。许多正规的研究往往都要做一些预备性试验，以找准因素及因素水平。

2、 单因子试验

单因子试验中，各项条件和因素都维持在一般水平上，只变动一个因子，以找出这一因子对试验的影响和影响的程度。例如MS培养基，其它成分和用量都不变，只变动NAA的用量在0 , 0.1, 0.5, 1.0mg/1之间，以找出NAA用量对某一培养生根的影响。这就是单因子试验。单因子试验，除了要研究的那一个变量以外，其余各方面都应尽量相同或者尽可能相近，实验应安排得很简单。一次变化一个因素，并把全部情况详细记录。通常在进行了预备性试验后，接着再安排一次较全面的单因子试验，就能确定该因子与试验结果之间的相互数量关系。

生物学试验不同于物理学或化学实验的地方很多，最重要与最显著的差别是在生物学试验中必要设置对照组与实验组，试验组可以有一组或几组，随试验的复杂性增加，对照组也可能有一组以上。要求对照组与试验组中的试验个体，即植物组织块或其它培养物，必须在遗传性、生理状态、前培养条件等等方面，尽可能完全一致（这在组织培养的工作中比较容易做到）。这是因为生物学研究对象的可变因素太多，许多事项难以直观地记录，也不便于将其转换为数字。试验材料来源不纯、不整齐，以后发生了变化，就会说不清是由于试验因子产生的效果，还是因材料之间不同所产生的结果。对照组通常不施加试验因子处理，或维持原先的培养条件。

在各组处理项目上，通常要用一定数量的试验材料，因此必须有一定数量重复。随试验规模和要求不同，大多每个项目要有4—10瓶，每瓶至少3块培养物或3丛小幼苗。这些材料接入的数量和质量都应细心地尽可能保持一致。设置的重复数量越大，试验进行的越仔细，所取得的结果也就越可靠。所得到的试验结果都应经过适当的数学处理，以便能够比较客观地评判试验结果的准确度与可信度。

3、多因子试验及正交设计

近几年来，由于有了现代统计学等数学方法的帮助，已有可能设计同时试验几个因子的若干个水平的复杂试验了。这样做已表现出了极其显著的优点，即节省时间和精力，同时提供了几个可变因子在交互作用时的效果。例如，采用正交设计，在使用L9表时就可以安排4个因子，3种水平的试验，一共做9种不同搭配的试验，其结果相当于做了27次种种搭配的试验。正交试验虽然是多个因素搭配在一起的试验，但是在试验结果的分析中，每一种因素所起的作用却又能够明白无误地表现出来。因此一次系统的试验结果，就可以把问题分析的清清楚楚，用有限的时间取得成倍的收获。在植物快速繁殖研究中，可用于同时探究培养基中适宜的几种成分的用量，如细胞分裂素、生长素、糖和其它成分的用量。当培养物有切实可靠的指标便于观察计算，即比较容易进行定量化处理的情况下，采用多因子试验都能起到推进试验进程的作用，收到事半功倍的效果。比如出苗数量、苗的高度、生根数量、根长度、移栽成活率等等。

在没有上述明确的可计数的指标时，如愈伤组织的生长状况，生长量、分化潜力等，可以根据经验目测，采用评定记分的方法，将状况与质量指标转黄为数字，再进行统计学处理。严格地说，上述指标经过仔细的测定分析，也可以定量化。比如愈伤组织的生长量，可以通过先称取空瓶（带培养基）重，接种后再称取重量，两次重量之差，便是初始接种物的初重量。经过一段时间的培养，先取出培养物（因不便无菌称量，如培养物不保留，则可直接称培养物）转移到已称量好瓶重的新鲜培养基上，再称量瓶重，求出培养物的末重量。初始重量之差，便是培养物的生长量。也可设置对照，称取干重量。可见手续很麻烦。在涉及到分化状况及潜力时，通过制备切片经显微镜观察，也能定出切合实际的数量指标，但上述过程只能用于确有价值的理论研究中。在大多数应用项目中，则嫌其过于繁琐而没有实用价值。凭经验判断打分的办法，误差因素太大，因此，在这种没有具体数字指标试验中，还是以单因子试验比较能说明问题。否则各因子之间的作用交织在一起，常使结果无法解释。

4、 逐步添加和逐步排除的试验方法

在植物组织分化与再生的研究中，在没有取得可靠的分化与再生之前，往往添加各种有机营养成分，而在取得了稳定的再生之后，就可以逐步减少这些成分。在逐步添加时是使试验成功，在逐步减少时是缩小范围，以便找到最有影响力的因子，或是为了实用上的需要竭力使培养基简化，以降低成本和利于推广。在寻求最佳激素配比时，也经常用到这种加加减减的简单方法。

（二） 主要培养条件及影响因子的选取

1、 基本培养基的选择

在已成功的试管繁殖的植物种类中，以采用MS为基本培养基的为最多。因此，在一般的培养中可先试用，如发现有不利的影响，或不够理想，要想对基本培养基加以改进的话，最好首先降低MS培养基的浓度，其次，可以选择在配料成分上与MS培养基有显著不同的其它培养基加以试用对比，如B5、White、Nitsch培养基等。通常微量元素和铁盐不必配成许多种，只按MS微量元素的配方配成，可用于其它培养基成分中。混合的微量元素一般配成的浓度是每升培养基中加入1ml或5ml。在取得稳定的分化增殖时，微量元素可以减少甚至省略。配方中微量元素用量也有很大差异，如ER培养基中的用量，就只有MS配方中的1/10。培养基中的有机成分变化最大，不必拘泥于某一配方的要求。在遇到难以分化的材料时，常常是增加培养基的复杂性，不断加添可能有希望的营养成分或者生理学上的活性物质，在培养成功后再逐步减去。因此可能发现，一些成分在推进试验结果方面，其实是些无关的因素。但是其中有些是起了推进作用的。在试验没有成功时，加入总比不加入好，多数有机成分的用量都不宜过高，如生物素常用0.01—0.1mg/1。某些有机物是植物组织生长分化的必需物质，是代谢环节中的电子传递体，在整体植物中它们可以自行合成，离体组织则合成减少或不能合成，或因伤口面积剧增、代谢消耗加强而供应不足，因此，即使加入很少，有和没有是不一样的。

基本培养基选取的实例：把月季丛生苗分别接种到MS、B5和White三种培养基上，这三种培养基除基本的无机盐配方以外，其它成分都完全相同。培养1个月以后，可以看到一点变化，第二个月，转接一次继续培养，第三个月再转接一次。这样，大约在第三个月末或第四个月初，即可看到这三种培养基对月季幼苗生长与增值的影响。其中以MS培养基最好，苗生长快，增值倍数高；B5培养基较差；而White培养基最差，幼苗生长慢，增值倍数低。试验结果如以MS为100%，B5约为86%，White约为73%。这样就可以选择MS培养基为基本条件，用于月季的试管繁殖。在这个例子中，三种培养基互为对照组，或认定MS处理的为对照组。

2、 植物激素配比的选择

从植物组织培养文献中所累积的资料看，要使植物组织分化出苗和使苗能快速增值，选择植物激素的种类和调节细胞分裂素与生长素的用量是最重要的一环。形象化地说：这是最灵敏的一个旋钮。

在选定或者暂时认定某一基本培养基后，或者同时，通常首先要考虑的都是植物激素的配比。例如，采用MS培养基，细胞分裂素用BA，生长素用NAA，用量：BA暂定为2mg/1，NAA暂定为0.1或者0.2mg/1,这样的培养基现在通用的写法为：MS+BA2+NAA0.1—0.2。培养温度为24—26℃,每天光照10小时。这种培养基和条件已使比较容易再生的上百种植物顺利分化和增值，初试不妨先试一试。

培养一段时间以后，可以根据大多数培养物及其中少数组织块的表现，来修订下次培养基中植物激素的用量。这一过程，也就是收集培养物对培养基及培养条件的“意见”。培养物的各种表现说明什么问题，以及应当如何调整，后面要做详细介绍。

预备试验也可以一种以上，如除上面一种以外，可扩展为：MS+BA1+NAA0.1，MS+BA3+NAA0.1等，如培养物反应不理想，可以查阅、参考近似科、属和属内其它种的培养条件。

选取不同激素用量也可以用两组单因子试验来进行：第一组找出适宜的BA用量，第二组找出适宜的NAA用量。

第一组 1—1 MS+BA1+NAA0.1

1—2 MS+BA2+NAA0.1

1—3 MS+BA4+NAA0.1

在这组试验中NAA的用量不变，注意观察BA对培养物的影响。

第二组 2－1 MS+BA2+NAA0.05

2－2 MS+BA2+NAA0.1

2－3 MS+BA2+NAA0.5

在这组试验中BA的用量不变，注意观察NAA对培养物的影响。

象这样比较简单的试验，就用不着BA和NAA两个因子都同时变。从试验结果中可以选出较优的一两种处理，或可预示在上两组试验中未曾出现的组合，需要调整后再继续试验。比如上述试验中1-2较好，2-3较好，重新试验时，就可以选MS+BA2+NAA0.5的激素配比。

也可以计量级变化更大的试验，作预选，形象地说进行筛选的“筛眼”更粗大些，探测范围更宽些。如BA选定1、3、5mg/1；NAA选定为0.05、0.5、5mg/1;或者0.01、0.1、1.0、5.0mg/1等等。在这组试验结果明朗以后，比较优组合为出发呆呢再设计新的组合，并将量级划小，两三轮试验后，定可找到最佳的激素组合。

对于许多植物来说，这样的试验已足够了。特殊情况下，如解决不了问题，就可进一步选用KT、ZT、2-ip等其它细胞分裂素，以及IAA、IBA、2,4-D等其它生长素，并试用正交试验法、优选法等安排多因子的试验。以细致耐心的多次试验，逐步缩小包围圈，最后找到适宜的细胞分裂素、生长素的种类与用量，使该种植物能顺利地高速繁殖。

应当记住，所有试验应在相同的培养基上重复继代2-3次，以确证其效果。如果把少量试验材料在颇大差异的培养基上转来转去，弄得试验结果无法分析，是不能提供真实数据的。最妥善的办法是加大工作量，重新开始，消毒和接种更多的试材，并仔细试验与观察。

3、 糖浓度的选取

采用单因子试验，或结合植物激素的选取，采用正交试验来确定最佳糖浓度。通常选择的幅度很小。对大多数植物来说，适宜的浓度为20或30g/1,个别情况用到40g/1.在花药培养时变化幅度较大，有时用到70—150g/1。

4、 PH值的选取

一般植物对PH值的要求不很严格，如山茶、杜鹃和叶子花等，可以适当降低PH值到5.4或5.0。试用于新培养的种类时，可参考过去已发表的类似植物。采用只变动PH值的单因子试验，可以迅速了解到适宜的PH值。第一次可试用PH5.0、5.4、5.8及6.2，等第一次结果出来后，再细调一次，即可确定出最佳PH值。

在培养过程中，培养基的PH值会随养分消耗而变动，因此量级差别太小时，试验结果的差异也不明显，只要培养物的生长增值能满足快速繁殖的要求，就不必过于精心。

5、 温度和光照

在没有专门的设备条件下，温度和光照要求的选取也不必过细。利用培养架的顶部、中部、下部，分别放置培养瓶和温度计，经过一段时间的培养，即可比较出该植物需要的温度范围。对光强的需要，可通过植物距离光源的远近不同来比较得出。没有特殊的需要，一般不做光周期的研究，打多数专家认为10-14小时光照时必需的。

有条件的单位可以购置光照培养箱。这种设备可以准确地控制每天光照的时间，即可任意控制光照和黑暗的周期性变化，光强度可通过灯盏的数目给予调节。设有升温和降温装置，能调到任意，变化范围在+1℃左右。光照培养箱对于研究培养物的春化处理和光周期对植物发育的影响是较理想的。箱内的湿度只能作大体上的调节，但这一点关系并不很重要，因为培养瓶中的湿度一般都是打到100%的。如果妥为利用，在这样的试验条件下，能够影响植物生长发育的几个最重要的因素，都已在人为地控制下了。这是目前在微型整体水平、组织或器官水平、细胞水平上能比较精密控制的较理想的设备。用这种光照培养箱当然可以方便迅速地找出某种植物快速繁殖所要求的最佳温度和最佳光照条件。

6、 综合因子的最终确定

在各个单项因子的最佳条件找到以后，将这些最佳条件综合到一起，进行全面实验，并根据实验结果，再做适当调整，试验工作就可结束，将研究成果扩大，应用到大规模的快速繁殖中去。

调查草原中植物的种群密度常见的取样方法

一、 目的与要求

通过调查研究,对植物群落作综合分析,找出群落本身特征和生态环境的关系,以及各类群落之间的相互联系.

二．用品与材料

1．测量仪器：指南针,经纬仪,气压高度表,测绳,计步器.

2．调查测量设备：钢卷尺,剪刀,标本夹,采集杖,各种表格,记录本,标签.

3．文具用品：彩笔、铅笔、橡皮、小刀、米尺、绘图薄、资料袋等.

4．采集工具：铁铲、枝剪、土壤袋、标本夹、标本纸、放大镜、昆虫采集箱.

三、内容与方法

（一）样地的设置

1.取样数目

如果群落内部植物分布和结构都比较均一,则采用少数样地；如果群落结构复杂且变化较大、植物分布不规则时,则应提高取样数目.

2．取样技术

无样地取样技术（指不规定面积的取样,如点四分法.）、有样地取样技术（指有规定面积的取样,如样方法（最小面积调查法）、样线法）.

（1）样方法：在一块样地单位上选定样点,将仪器放在样点的中心,水平向正北0°,东北45°,正东90°引方向线,量取相应的长度.则四点可构成所需大小的样方.

① 样方的范围：选择具有代表性的小面积统计植物种类数目,并逐步向外围扩大,同时登记新发现的植物种类,直到基本不再增加新种类为止.

② 面积扩大的方法

A.从中心向外逐步扩大法：通过中心点0作两条互相垂直的直线.在两条线上依次定出距离中心点的位置.将等距的四个点相连后即可得到不同面积的小样方.在这些小样地中统计植物种数.如图1.

B．从一点向一侧逐步扩大法：通过原点作两条直角线为坐标轴.在线上依次取距离原点的不同位置,各自作坐标轴的垂线分别连成一定面积的小样地.统计植物种数.

C．成倍扩大样地面积法：按照图3所示方法逐步扩大,每一级面积均为前一级面积的2倍.

③ 记录方法：以面积大小为x轴,以种数为y轴,填入每次扩大面积后所调查的数值.并连成平滑曲线.则曲线上由陡变缓之处相对应的面积就是群落的最小面积.

④ 植物群落调查所用的最适样方大小：乔木层惯用样方大小为10×10~40×50m2,灌木层为4×4~10×10m2,草本层为1×1~3×3.3m2.

⑤ 样方数目：乔木：2个；灌木：3个；草本：5个.

（2）样线法

① 样线的设置：主观选定一块代表地段,并在该地段的一侧设一条线（基线）.然后沿基线用随机或系统取样选出待测点（起点）.沿起点分别布线进行调查.

② 样线的长度和取样数目：草本：6条10m样线；灌木：10条30m样线；乔木：10条50m样线.

③ 样线的记录：在样线两侧0.5m范围内记录每种植物的个体数（N）.

（3）四分法（中心点四分法,中点象限法）

① 样点选定：在选定调查地块之后,在调查地块内随机布点（样点）.每个调查地段的取样点理论值至少要20个点.

生物研究的6个基本方法

调查草原中植物的种群密度常用的取样方法包括样方取样、网格取样和点取样等。

1、样方取样：样方取样是一种常见的植物种群密度调查方法，它可以通过选定一个区域，将其划分为若干个相等大小的样方，然后在每个样方内进行调查，统计植物种群数量来实现。样方大小可以根据调查区域的大小和植物种群密度来确定，一般而言，样方大小应该大于植物种群的繁殖单元，例如种群中的最小繁殖单元 （例如种子）。

2、网格取样：网格取样是一种在平面上进行调查的方法，它可以用于调查植物种群密度和物种多样性。具体做法是选定一个区域，将其划分为若干个相等大小的网格，然后在每个网格内进行调查，统计植物种群数量。网格大小可以根据调查区域的大小和植物种群密度来确定。

3、点取样：点取样是一种在空间上进行调查的方法，它可以用于调查植物种群密度和物种多样性。具体做法是选定一个点，然后在该点周围进行调查，统计植物种群数量。点的大小可以根据调查区域的大小和植物种群密度来确定。

植物的种群密度是指在一个区域内，某一物种的植物数量每平方米内有多少株。它通常用于描述植物种群的数量和分布情况，是生态学研究中的重要内容之一。

生物研究的6个基本方法如下：

1、显微观察法：如“观察细胞有丝分裂”“观察叶绿体和细胞质流动”“用显微镜观察多种多样的细胞”等。

2、观色法：如“生物组织中还原糖。脂肪和蛋白质的鉴定”“观察动物毛色和植物花色的遗传”“DNA和RNA的分布”等。

3、同位素标记法（元素示踪法）：如“噬菌体浸染细菌的实验”“恩格尔曼实验”等。

4、补充法：如用饲喂法研究甲状腺激素,用注射法研究动物胰岛素和生长激素,用移植法研究性激素等。

5、摘除法：如用“阉割法。摘除法研究性激素。甲状腺激素或生长激素的作用”“雌蕊受粉后除去正在发育着的种子”等。

6、杂交法：如植物的杂交。测交实验等。

7、化学分析法：如“番茄对Ca和Si的选择吸收”“叶绿体中色素的提取和分离”等。

8、理论分析法：如“大。小两种草履虫的竞争实验”“植物向性动物的研究”等。

9、模拟实验法：如“渗透作用的实验装置”“分离定律的模拟实验”等。

10、引流法：临时装片中液体的更换,用吸水纸在一侧吸引,于另一侧滴加换进的液体。

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